Diversity and characterisation of coagulasenegative staphylococci isolated from healthy individuals in Portugal

In the past few years the interest in coagulase-negative staphylococci (CoNS) has significantly increased in human medicine. CoNS are common commensal colonisers of the human skin, although now also recognised as major nosocomial pathogens. Over the last decades, several studies have been carried out in order to understand the pathogenicity mechanisms of CoNS. The well known determinants in the pathogenesis of CoNS infections are their ability to form biofilms and an exceptional resistance to several antibiotics. Nevertheless, there is a lack of studies regarding the commensal lifestyle of these microorganisms. Additionally, it is now hypothesised that commensal bacteria might be a reservoir of pathogenic determinants. Therefore, the work described throughout this thesis was aimed to perform a phenotypic and genotypic characterisation of different CoNS species isolated from healthy Portuguese individuals. A total of 61 CoNS isolates, comprising 7 different species, were obtained and characterised at the level of biofilm formation and antibiotic susceptibility profiles. According to the results, biofilm formation ability and presence of biofilm-associated genes were commonly found features, highlighting their pivotal role in the colonising lifestyle of CoNS. This study also addressed the correlation between phenotypic and genotypic characteristics of biofilm formation, corroborating and raising questions about the importance of some genes in this process. Moreover, it was observed a great proportion of isolates with decreased susceptibility and multiple resistances to some important antibiotics. A significant association between antibiotic resistance and biofilm formation was also demonstrated, and some hypotheses about the nature of such association were provided. Lastly, the expression patterns of two biofilm-associated genes at two distinct biofilm developmental stages were determined, confirming their importance in the accumulative stage of biofilm formation. Overall, the results presented in this thesis indicate that staphylococcal skin flora might be an important reservoir of potentially pathogenic bacteria and, simultaneously, bring to light new perceptions about the molecular basis of staphylococcal biofilm formation, and the nature of the association between antibiotic resistance and biofilm formation.

Deteção eletroquímica da norfloxacina e trimetoprim em amostras de urina utilizando polímero molecularmente impresso modificado e grafeno

A norfloxacina e o trimetoprim são dois antibióticos antibacterianos usados para o tratamento de infeções urinárias, intestinais e respiratórias. A maioria dos fármacos exige uma dosagem que garanta os níveis de segurança e eficácia de atuação. A necessidade de dosear os medicamentos e os seus metabolitos é assim um controlo imperioso e em muitos casos regular no tratamento de um paciente. Neste trabalho desenvolveram-se dois sensores eletroquímicos para a deteção da norfloxacina (NFX) e do trimetoprim (TMP), usando como superfície de suporte o carbono vítreo. A busca de novos materiais que conferiram maior seletividade e sensibilidade aos sistemas de deteção e por outro lado apresentem menores riscos para o paciente quando usados em dispositivos que permitam uma análise point-of-care, é especialmente importante e pode ser uma parte crucial do processo de decisão clínica. Assim, os polímeros molecularmente impresos enquadram-se nesse perfil e o seu uso tem vindo a ser cada vez mais avaliado. A impressão molecular é uma tecnologia capaz de produzir polímeros que incorporam as moléculas do analito e que após remoção por solventes específicos, permitem dotá-los de locais específicos de reconhecimento estereoquímico. A seleção do pirrol como polímero molecularmente impresso (MIP) permitiu construir com sucesso os sensores para doseamento dos antibióticos. A fim de aumentar a sensibilidade do método incorporou-se grafeno na superfície do elétrodo. Este material tem vindo a ser largamente utilizado devido às suas propriedades: estrutura molecular, condutividade elétrica e aumento da superfície são algumas das características que mais despertam o interesse para a sua aplicação neste projeto. Os sensores desenvolvidos foram incorporados em sistemas eletroquímicos. Os métodos voltamétricos aplicados foram a voltametria cíclica, a voltametria de onda quadrada e ainda a impedância. As condições de análise foram otimizadas no que respeita à polimerização do pirrol (concentração do polímero, número de ciclos de eletropolimerização e respetivos potenciais aplicados, tempo de incubação, solvente de remoção do analito), ao pH da solução do fármaco, à gama de concentrações dos antibióticos e aos parâmetros voltamétricos dos métodos de análise. Para cada um dos antibióticos um elétrodo não-impresso foi também preparado, usando o procedimento de polimerização mas sem a presença da molécula do analito, e foi usado como controlo. O sensor desenvolvido para o trimetoprim foi usado no doseamento do fármaco em amostras de urina. As amostras foram analisadas sem qualquer diluição, apenas foram centrifugadas para remoção de proteínas e algum interferente. Os sensores construídos apresentaram comportamento linear na gama de concentrações entre 102 e 107 mol/L. Os resultados mostram boa precisão (desvios padrão inferiores a 11%) e os limites de deteção foram de 8,317 e 1,307 mol/L para a norfloxacina e o trimetoprim, respetivamente. Para validação do método foram ainda efetuados ensaios de recuperação tendo obtido valores superiores a 94%.

Avaliação do efeito de um probiótico na performance zootécnica e microbiota entérica em coelhos (Oryctolagus cuniculus) de produção

A cunicultura é uma atividade pecuária em crescente desenvolvimento e isso traduz-se em novos desafios. Durante muitos anos a criação de coelhos recorreu em demasia ao uso de antimicrobianos com o objetivo de tratar e prevenir o aparecimento de diversas doenças. Paralelamente, estes compostos foram também usados como “promotores de crescimento”, visando essencialmente uma melhoria da eficiência digestiva. Porém, o uso indiscriminado destas substâncias levantou questões de saúde pública, como a emergência de estirpes bacterianas multirresistentes e a inerente disseminação de genes de resistência, possivelmente transferíveis ao Homem através da cadeia alimentar. No presente, existe uma enorme pressão para a adoção de estratégias que possibilitem uma redução massiva na quantidade de antimicrobianos administrados a espécies pecuárias. Este trabalho visou contribuir para o estudo de uma alternativa ao uso de antimicrobianos - os probióticos – enquanto suplementos alimentares constituídos por microrganismos vivos capazes de equilibrar a microbiota intestinal do hospedeiro. Para tal, foram constituídos dois grupos de coelhos com base na alimentação: i) grupo antibiótico, com acesso a um alimento composto suplementado com antibióticos e ii) o grupo probiótico alimentado com a mesma dieta, mas sem antibióticos e inoculado com um probiótico constituído por Escherichia coli e Enterococcus spp.. Ao longo de 22 dias de estudo foram monitorizados alguns indicadores produtivos e efetuadas recolhas periódicas de fezes para estudo microbiológico. A análise dos resultados zootécnicos permitiram verificar que o uso de probióticos em detrimento de antibióticos parece promover o crescimento de coelhos, tornando-se um método mais rentável na produção cunícula. Através de genotipagem por ERIC-PCR e PFGE, pretendeu-se verificar se as estirpes estranhas ao trato gastrointestinal dos coelhos seriam capazes de coloniza-lo, permanecendo ao longo do tempo de estudo. O facto de as estirpes inoculadas no probiótico terem sido encontradas ao longo dos dias de estudo nos coelhos aos quais foram administradas, sugere que os efeitos observados na performance zootécnica estejam relacionados com as estirpes administradas no probiótico, pelo que este poderá ser um sistema viável na substituição de antibióticos na alimentação de coelhos de produção.

O efeito das ações de educação na doença pulmonar obstrutiva crónica nos recursos de saúde, exacerbações e na autoeficácia: revisão sistemática

Introdução: A doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) é considerada uma das principais causas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, atingindo substancialmente o contexto económico e social. As ações de educação permitem capacitar o doente na gestão e controlo da sua doença, no desenvolvimento do empowerment e na aquisição de estratégias para melhorar os vários outcomes da doença crónica. Têm sido propostas como medidas para limitar a crescente carga e custos de saúde. Contudo, ainda se encontra incerta a sua eficácia nesta patologia. Objetivo: Analisar as implicações das ações educativas de self-management sobre a DPOC, nomeadamente ao nível da recorrência aos serviços de saúde, nas exacerbações, na autoeficácia e na medicação. Métodos: Estudos controlados e randomizados, escritos em inglês, que incluíram ações de educação de selfmanagement foram pesquisados em bases de dados MEDLINE, CINAHL, ScienceDirect. Outcomes analisados: número de exacerbações, recorrência aos serviços de saúde, autoeficácia e conhecimento da DPOC, recurso a antibiótico e/ou corticosteróides. Resultados: 12 artigos foram incluídos na revisão sistemática. O período de intervenção variou entre 3 a 18 meses e o número de participantes randomizados de 40 a 743. Foi observada uma diminuição da recorrência aos serviços de saúde e no aumento da autoeficácia e conhecimento da DPOC. Não foram observadas alterações na frequência de exacerbações nem no recurso a antibióticos e/ou corticosteróides. Conclusão: A implementação de ações de educação na DPOC mostrou trazer benefícios a nível da recorrência dos serviços de saúde e na autoeficácia e conhecimento acerca da DPOC. Contudo, mais estudos controlados e randomizados rigorosos são necessários.

Desenvolvimento de Métodos de Extração de Resíduos de Antimicrobianos e Quantificação em Amostras Alimentares

O leite é um alimento complexo, pela sua composição rico em água, proteínas, lípidos, vitaminas e minerais. Devido ao seu alto valor nutricional é fundamental para a amamentação de crianças e animais em crescimento, pois fornece componentes fundamentais para o desenvolvimento e manutenção da saúde. Os antimicrobianos são amplamente utilizados como uma medida terapêutica no tratamento de infeções bacterianas, profilaxia e como promotores de crescimento (aditivos). A presença de resíduos de antimicrobianos no leite pode representar riscos para a saúde humana, como reações alérgicas em indivíduos hipersensíveis e resistências. Os objetivos deste estudo são o desenvolvimento de novos métodos de limpeza e de pré-concentração para amostras de leite, por meio de extração em fase sólida (SPE), com a finalidade de realizar uma melhor identificação e quantificação de antimicrobiana por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC). Todos os métodos desenvolvidos são de fácil execução, com taxas de recuperação dos agentes antimicrobianos viáveis, com uma percentagem de recuperação a partir de 85%. O método cromatográfico utilizado para a deteção e quantificação (HPLC-DAD) têm os limites de deteção (LD) entre 2.43ng / mL e 1.62ng / mL e os limites de quantificação (LQ) entre 7,36 ng / mL e 4.92 ng / mL, o que significa este método vai de encontro às diretrizes estipuladas pela União Europeia para os agentes antimicrobianos estudados. A combinação dos métodos propostos de limpeza e pré-concentração por SPE e multirresíduo por HPLC-DAD permite, por conseguinte, a deteção e quantificação de resíduos de antibióticos no leite, tornando esta uma alternativa importante e útil no processo de controlo de qualidade para a indústria de alimentos e outras área.

Avaliação de funcionamento de duas estações de tratamento de águas residuais do interior de Vila Nova de Gaia

Esta dissertação descreve o trabalho desenvolvido ao longo de um ano e um mês desde a pesquisa teórica até à prática experimental no âmbito da unidade curricular de Dissertação/estágio do Mestrado em Engenharia Química, no ramo Tecnologias em Proteção Ambiental. O tema desta dissertação consiste na avaliação do funcionamento de duas estações de tratamento de águas residuais (ETAR) do interior do município de Vila Nova de Gaia no que diz respeito ao possível aumento da resistência a antibióticos na ETAR de Febros e na ETAR de Lever. Os testes de sensibilidade a antibióticos (TSA) foram executados para ambas as ETAR, sendo as amostras de água recolhidas na entrada e na saída dos reatores biológicos (tratamento secundário). Além disso, foram realizados testes de avaliação da eficiência de desinfeção por radiação ultravioleta (UV) relativamente à Escherichia coli (E. coli) na ETAR de Lever. Os antibióticos selecionados para a realização deste trabalho foram a Eritromicina, a Azitromicina, a Claritromicina, a Ofloxacina, a Ciprofloxacina, o Sulfametoxazol, o Trimetoprim e o Metronidazol. Esta seleção baseou-se no facto de estes serem alguns dos antibióticos mais consumidos e mais persistentes no meio ambiente. A bactéria E. coli (isolada a partir de amostras das águas residuais estudadas) foi escolhida para a realização deste estudo uma vez que está sempre presente nas águas residuais domésticas e está associada a fenómenos de multirresistência a antibióticos. Os testes de TSA foram realizados seguindo a metodologia de difusão por discos. No período do estudo (Março a Junho de 2015) identificaram-se situações quer de aumento de resistência quer de aumento de sensibilidade aos antibióticos testados. As situações mais graves de aumento de resistência, a que corresponderam a halos nulos, verificaram-se para os antibióticos Claritromicina, Trimetoprim e Metronidazol, ocorrendo com maior frequência para os dois últimos, que aliás são fármacos que são administrados em simultâneo. Os períodos mais problemáticos em termos de aumento das resistências foram ligeiramente diferentes nas duas ETAR. No caso da ETAR de Febros correspondeu ao mês Abril e na ETAR de Lever ocorreu entre o final de Abril e o início de Maio. Considera-se que estes períodos poderão coincidir com um aumento do consumo destes fármacos devido à sua utilização no combate a infeções respiratórias muito comuns nesta altura do ano. Não se observou qualquer sensibilidade da E. coli para o Metronidazol porque é um antibiótico com indicação para algumas bactérias anaeróbias, fungos e giardia, e que à partida não tem capacidade para eliminar a E. coli. A eficiência da desinfeção na ETAR de Lever relativamente à remoção de E. coli foi satisfatória. Sendo de salientar a importância da manutenção, no que se refere à identificação de possíveis avarias nas lâmpadas e correspondente limpeza. Os resultados deste trabalho provam a existência de estirpes da bactéria E. coli resistentes a alguns dos antibióticos estudados, o que reforça a importância da desinfeção no tratamento de águas residuais domésticas.

Estudo da atividade biológica de líquidos iónicos baseados em bis-piridínios em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas

As resistências aos antibióticos estão a tornar-se um problema de saúde pública, estando a preocupar as várias entidades mundiais. Assim sendo, a descoberta de novas alternativas para combater infeções microbianas é crítica. Os líquidos iónicos (LIs) surgem, neste contexto, como um recurso a ser utilizado na indústria farmacêutica, nomeadamente na síntese de novos antibióticos. LIs demonstram a capacidade de melhorar as características dos ingredientes farmacêuticos ativos (API). No entanto, esta não é apenas a relevância destes compostos: propriedades antimicrobianas também têm sido descritas. LIs combinados com APIs ou LI como um API estão a dar uma nova perspetiva aos antibióticos. Os bis-piridínios estão, agora, a ser alvo de estudos também nesta área. Propriedades antimicrobianas de bis-piridinio têm sido descritas. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade de sais bis-piridínios como antimicrobianos. Os LIs derivados de bis-piridínio foram sintetizados e purificados pelo grupo Luís C. Branco da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, e usado após a confirmação das estruturas e pureza por ressonância magnética nuclear e espectrometria de massa. As bactérias utilizadas pertencem à coleção de Química e Biomoléculas da ESTSP. Para avaliar a atividade biológica dos compostos foram determinados os valores de concentração mínima inibitória (MIC), pelo método de microdiluição, de acordo com a metodologia do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). A determinação das taxas de crescimento também foi feita pelo método de microdiluição. Foram estudados 12 LIs contra 9 estirpes bacterianas, muitas das quais resistentes aos antibióticos. Apenas três dos compostos não mostraram nenhuma atividade antimicrobiana para as concentrações estudadas (<5 mM). Dois LIs mostraram atividade biológica contra todas as bactérias estudadas, incluindo o S.aureaus MRSA ATCC 43300. Seis dos sete restantes compostos demonstraram atividade biológica contra a maioria das bactérias estudadas. Só um composto mostrou atividade contra uma única bactéria. Os LIs bis-piridínios têm atividade biológica contra bactérias Gram-positivas e Gram- negativas, incluindo bactérias resistentes. Assim, estes compostos devem ser tidos em conta na busca de novas moléculas antibacterianas (síntese de novos antibióticos ou desinfetantes).